Xác định hàm lượng cysteine trong thực phẩm chức năng bằng phương pháp UV-vis sử dụng hạt nano vàng

Những năm qua, công nghệ nano đã có những bước phát triển nhanh, góp phần mang lại nhiều ứng dụng hữu ích trong cuộc sống, đồng thời mở ra nhiều hướng nghiên cứu mới để tiếp tục sử dụng hiệu quả công nghệ này. Góp phần quan trọng trong những thành tựu đó, nano vàng (nano Au) cũng đã có những bước khẳng định vị trí riêng, xuất hiện ngày càng nhiều trong các lĩnh vực.

Đầu tiên có thể kể đến là ứng dụng vào lĩnh vực bảo vệ môi trường như xử lý nước thải bằng màng thẩm thấu ngược, phát hiện ra các ion độc hại (ruud risel),… Trong lĩnh vực vật liệu: góp phần tạo nên điện trở màng mỏng (nadejda kresteva), đầu cảm thụ điện hóa, kết hợp với ống carbon nano (yu shi), xác định các cation kim loại nặng như Pb2+, Cr3+, Hg2+,… xác định các anion F-, CN-, AsAsO3, xác định các chất hữu cơ: axit nucleic, protein, acetamiprid, amoxicillin, dopamine, morphine, ibuprofen…

Ngoài ra, nano vàng cũng thể hiện khả năng tuyệt vời của mình trong bảo vệ DNA, phân tích protein, thí nghiệm hoạt động của enzyme, phân tích tế bào, phát hiện và góp phần điều trị bệnh ung thư, dẫn thuốc và chuyển gen, chất chống vi khuẩn… và vẫn đang tiếp tục được nghiên cứu để thể hiện tốt hơn nữa vai trò của mình trong lĩnh vực chăm sóc sức khỏe.

Cysteine (viết tắt là Cys hoặc C) là một α-axit amin với công thức hóa học: HO2CCH(NH2)CH2SH. Cysteine sở hữu đặc tính có vai trò như một trung tâm tạo phức chất chống oxy hóa và các thành phần tín hiệu nên rất quan trọng đối với cơ thể con người. Cysteine hoạt động như là một chất giúp bảo vệ cơ thể khỏi các tác nhân gây hại, giúp cân bằng nồng độ đường huyết, hỗ trợ điều trị rối loạn tâm thần... Với ý nghĩa đó, cysteine ngày càng nhận được nhiều quan tâm nghiên cứu, phân tích của các nhà khoa học.

Theo PGS. TS. Phạm Thị Ngọc Mai, gần đây, phương pháp UV-vis sử dụng hạt nano vàng đã được nhóm tác giả thuộc Khoa Hóa học, Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG Hà Nội nghiên cứu, ứng dụng thành công để xác định hàm lượng cysteine trong thực phẩm chức năng.

Hạt nano Au được tạo thành từ phản ứng giữa một lượng dung dịch nóng Chloauric với dung dịch Natri citrate (HAuCl4 + 3C6H8O7 (citric acid) -› 2Au + 3C5H6O5 (3-ketoglutaric acid) + 8HCl + 3C)

Quy trình điều chế dung dịch nano Au được thực hiện theo các bước: Lấy 50 mL dung dịch HAuCl4.3H2O 0,50 mM chuyển vào cốc chịu nhiệt 100 mL và đun dung dịch ở khoảng 100°C.Khi dung dịch sôi, thêm 5,00 mL Natri citrate 38,8 mM, khuấy mạnh bằng con khuấy từ. Đun dung dịch thêm khoảng 10 phút, đến khi dung dịch chuyển sang màu đỏ tươi, biểu thị sự hình thành các hạt nano Au.Làm nguội dung dịch đến nhiệt độ phòng và bảo quản ở 4°C trong tủ lạnh để sử dụng. Dung dịch bền trong khoảng từ 3-4 tuần.

Các hạt nano Au có hình cầu màu đỏ, dấu gạch ngang xung quanh biểu thị cho citrate mang điện tích âm. Sự hấp thụ của citrate trên bề mặt nano Au sẽ có điện tích âm, đẩy nhau.

Trong ysteinecó nguyên tử lưu huỳnh có thể hấp thụ trên bề mặt Au và làm giảm điện tích âm của nano Au, làm các hạt nano Au co cụm  lại với nhau và thay đổi màu sắc. Qua đó, có thể định tính hoặc xác định sự có mặt của cysteine trong mẫu.

Mối quan hệ giữa tỷ lệ độ hấp thụ quang ở 2 bước sóng cực đại với nồng độ cysteine trong dung dịch nano Au   

Tiếp tục nghiên cứu sâu hơn trên phổ hấp thụ nguyên tử UV-Vis của dung dịch nano Au mà chỉ có citrate cho thấy, có một phổ hấp thụ xuất hiện đỉnh ở khoảng 520nm, khi thêm cysteine vào, phổ này sẽ thay đổi và xuất hiện đỉnh quang phổ thứ 2 ở 650 nm. Đây cũng là cơ sở để định lượng hàm lượng cysteine bằng dung dịch nano Au.

Nghiên cứu các đặc trưng của dung dịch nano Au cho thấy, phổ hấp thụ quang được biểu thị ở đường quang 1 với bước sóng λ1 =520nm;khi có mặt cysteine,phổ hấp thụ được xác định ở (10-4M)(λ2=650nm). Chọn tín hiệu phân tích là tỷ lệ bước quang và bước sóng A650/520. Đây cũng là một nguyên tắc tương đối khác so với các nguyên tắc bình thường khác khi đo UV-Vis mà không phải dựng đường chuẩn biểu diễn mối tương quan của bước sóng nhất định.

Sử dụng kính hiển vi điện tử huỳnh quang (TEM) để nghiên cứu hình thái hạt nano Au khi không có mặt cysteine, cáchạt nano Au tổng hợp đượccóhình cầu và phân bố đều với đường kính hạt trung bình từ 18,1 –20,3 nm. Khi có mặt cysteine, các hạt co cụm lại với nhau thànhtừngđámlớn với kích thước từ 100-500 nm. Điều này giải thích cho sự thay đổi màu sắc của dung dịch cũng như thay đổi về phổ hấp thụ phân tử UV-Vis khi có hay không có mặt cysteine.

Nghiên cứu thế zetabề mặt của nano Au cho thấy, thế bề mặt của dung dịch citrate AuNPs là -29,4mV, điều đó chứng minh sự hấp thụ của ion citrate âm trên bề mặt. Khi có mặt cysteine với nồng độ 10-5M, thế bề mặt của dung dịch citrate – AuNPs tăng lên -28,7 mV,chứng minh sự hấp thụ cysteine trên bề mặt và làm thay đổi điện tích của nano Au, làm chúng co cụm lại với nhau.

Ở nồng độ muối NaCL khác nhau sẽ ảnh hưởng đến độ nhạy của phương pháp. Vì khi làm việc với điện tích bề mặt của các hạt nano Au, cường độ ion đóng vai trò rất quan trọng với lớp điện kép ở xung quanh bề mặt hạt. Khi tăng nồng độ NaCL lên thì tỷ lệ co cụm các hạt nano Au càng tốt (A650/520), tín hiệu phân tích cao và độ phân tích của phương pháp càng nhạy. Nồng độ muối NaCL là 10-4M là tối ưu cho phương pháp này - PGS. TS. Phạm Thị Ngọc Mai chia sẻ.

Tương tự khi khảo sát nồng độ pH từ 3 – 5 cho tỷ lệ A650/520 cao, khi pH tăng lên thì tỷ lệ A650/520 giảm xuống. Vì khi pH cao thìcitrate mang điện tích âm giảm đi, đồng thời, cysteine cũng mang điện tích âm nên đã làm tăng điện tích âm của các hạt nano Au, dẫn đến khả năng hấp thụ không tốt. Tối ưu cho phương pháp này là pH=5.

Nồng độ của dung dịch nano Au và thời gian phản ứng (tính từ lúc thêm Cysteine vào dung dịch nano Au) cũng có ảnh hưởng đến phương pháp, tỷ lệ A650/520 đạt cao nhất khi nồng độ dung dịch AuNPs = 10‐4M, thời gian phản ứng để cho mật độ quang ở A650 tốt nhất ở sau 2 phút.

• Khi tăng nồng độ cystein từ 10-5M đến 10-2M, tỷ lệ A520 nm giảm và A650 nm tăng dần (hình bên: Đường số 1 biểu thị nồng độ cysteine ở mức 10-5M và đường số 7 là cysteine ở 10-2M).

• A650/520 theo logCcysteine là cơ sở để định lượng cysteine trong dung dịch chứa hạt nano Au.

Đường 1-7: Phổ hấp thụ quang của dung dịch AuNPs với các nồng độ khác nhau, lần lượt là: 10-5M, 5.10-5M, 10-4M, 5.10-4M, 10-3M, 5.10-3M, 10-2M.     

Khảo sát khoảng tuyến tính của phương pháp cho thấy, tỷ lệ A650/520 theo logCcysteine trong nồng độ từ 5.10-6M đến 5.10-4M có mối quan hệ tuyến tính. Tuy nhiên, ở nồng độ cao hơn (5.10-3M) thì tỷ lệ tuyến tính này lại có xu hướng giảm. Như vậy, ở nồng độ cao hơnmức độ co cụm của các hạt nano Au đã bão hòa và khoảng đường chuẩn có thể xây dựng ở khoảng 5.10-6M đến 5.10-4M.

Đường chuẩn thu được có hệ số tuyến tính R2=0,9969. Từ đó, xác định được các giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương pháp tương ứng: LOD=1,42.10-6 (mol/l); LOQ=3,26.10-6(mol/l); Khoảng tuyến tính: 3,26.10-6 – 5.10-4M.

Tiến hành phân tích lặp lại 5 lần với nồng độ cysteine ở đầu và cuối đường chuẩn là 1,21 ppm và 12,12 ppmđể đánh giá độ đúng, độ lặp lại, ở cả 2 nồng độ này cho độ lệch chuẩn tương đối (CV) từ 4,17 đến 4,57 và nhỏ hơn 5%, độ lệch so với đường chuẩn nhỏ hơn 3,34%, đáp ứng yêu cầu và phù hợp để phân tích mẫu thực tế là thực phẩm chức năng được mua ngẫu nhiên trên thị trường, nồng độ 2,5 mg cysteine/viên.

Cân chính xác 1 lượng thuốc trên cân phân tích => hòa tan lượng thuốc trong 20,00mLdung dịch axit HCl 0,5M =>Rung siêu âm đến khi mẫutan hết =>Lọc dung dịch và phân tíchtrên thiết bịUV-Vis.Kết quả2 lần đo cho hàm lượngcysteine tìm được sai khác rất nhỏ so với hàm lượng ghi trên nhãn sản phẩm, hiệu suất thu hồi đạt 93 đến 96%.

Đối chứng phân tích 3 mẫu bằng phương pháp HPLC và phương pháp UV-Vis cho thấy, kết quả sai lệch không nhiều.

Kết quả này đã mở ra triển vọng mới về phương pháp xác định hàm lượng cysteine trong thực phẩm chức năng bằng UV-Vis sử dụng hạt nano Au, PGS. TS. Phạm Thị Ngọc Mai chia sẻ.

Suckheocuocsong.com.vn/Theo Tạp chí thử nghiệm ngày nay