Phương pháp xác định độc chất từ phủ tạng động vật thí nghiệm

Trong quá trình xin đăng ký lưu hành một loại dược phẩmhay một loại thuốc bảo vệ thực vật mớiđể được phép lưu hành thì điều kiện tiên quyết là phải xác định được tác động và ảnh hưởng của chúng đối với con người, động vật và môi trường sinh thái. Vì vậy, việc thử độc tính trên động vật thí nghiệm là điều kiện bắt buộc để cung cấp hồ sơ tài liệu cho việc đăng ký lưu hành sản phẩm mới.

Trong thử độc tính, ngoài việc quan sát các triệu trứng lâm sàng, các biểu hiện ngộ độc trên động vật thì việc xét nghiệm các độc tố tích lũy trong các cơ quan nội tạng của động vật thí nghiệm là rất quan trọng đểxác định sự  tồn trữ  của các chất  thí nghiệm. Trên cơ sở đó,đánh giá độc tính của một loại chế phẩm xin đăng ký.

Các phương pháp xác định độc tính trong phủ tạng động vật thí nghiệm.

1.Cách lấy mẫu phủ tạng để xác định chất độc trong phủ tạng động vật thí nghiệm

Mẫu thử trong phân tích độc chấtở động vật thí nghiệm thường rất đa dạng và chứa nhiều tạp chất. Chúng có thể là các mẫu phủ tạng(dạ dày, tim,gan…),các dịch sinh lý nhưmáu, nước tiểu,chất nôn, dịch dạ dày,các chất chứa trong dạ dày hoặcxương, lông, móng, vv...của động vật.

Tùy theo cách bố trí thí nghiệm, đường gây ngộ độc và đặc tính phân tán (động học)của các chất độc trong cơ thể sau ngộ độc mà chất độc có thể tích lũy trong dạ dày, trong gan, trong máu, trong nước tiểu.  Đó cũng là căn cứ để lấy mẫu xác định chất độc tồn trữ trong phủ tạng của động vật thí nghiệm.

Thông thường, ngộ độc theo đường tiêu hóa các chất độc thường tích lũy trong dạ dày, máu và nước tiểu.Ngộ độc thuốc ngủ bacbituric,chất độc tích lũy trong não.Ngộ độc các hợp chất asen, các chất độc tích lũy nhiều trong xương, lông, móng.Ngộ độc axit HCN hay các muối Cyanua chất độc tích lũy nhiều trong máu.

Tùy theo loài động vật thí nghiệm và yêu cầu phân tíchđộc chất mà quyết định số lượng phủ tạng phải lấy để phân tích, thí nghiệm. Các động vật nhỏ lấy toàn bộ các cơ quannội tạng, các động vật lớn lấy một phần nhưng không ít hơn 300g. Chú ý lấy ở các bộ phận mà chất độc tích lũy nhiều nhất trong cơ thể động vật. Muốn vậy, người lấy mẫu phải hiểu rõ tính chất sinh hoá, lý hoá và dược động học của chất độcthí nghiệm để có thể lấy loại phủ tạng nào mà ở đó có khả năng tích lũychất độc nhiều nhất.Thông thường, sau khi vào cơ thểcác chất độc được lưu trữ trong gan, máu, nước tiểu, dịch dạ dày.

Tùy thuộc vào mục đích nghiêncứu, khảo sát mà phải lấy riêng từng loại phủ tạng hoặc lấy nhiều loại phủ tạng khác nhau và xác định khối lượng của từng loại phủ tạng trước khi xử lý mẫu.  Ghi chính xác khối lượng từng loại phủ tạng đã lấy để phân tích, xét nghiệm trước khi xử lý mẫu làm cơ sở cho sự tính toán sau này.

2. Quy trình xử lý mẫu phủ tạng động vật thí nghiệm

Nếu số lượng mẫu phủ tạng động vậtíthơn150g ta chia mẫu thành 02 phần:

-01 phần để xác định chất độc bay hơi, bã còn lại để vô cơ hoá tìm các chất độc vô cơ.

- 01 phần để xác định các chất độc hữu cơ.

Nếu số lượng mẫu phủ tạng lấy được rất ít (dưới 50g),phải lần lượt tiến hành xác định các chất độc bay hơi.Sau đó, phần bã được ngâm cồn có thêm acid tactric để đạt tới pH=4-5,lọc, loại albumin, chiết xuất nhiều lần liên tiếp ở 2 môi trường axit và kiềm để tìm chất độc hữu cơ. Phần bã và giấy lọc sau đó được vô cơ hoá để tìm chất độc vô cơ.

Thông thường, khi làm thí nghiệm thử độc tính trên động vật, người thực hiện đã biết rõ loại thuốc đó là gì. Như vậy,có thể bỏ qua phần thử định tính. Công việc còn lại chỉ là xác định lượng tồn dư của các chất độc đó trong các cơ quannội tạng của động vật thí nghiệm. Do vậy, cần lấy riêng từng loại phủ tạngvà xác định chất độc tồn dư trong loại phủ tạng đó.

Trong trường hợp đánh độc cùng một lúc nhiều loại chất độc khác nhau, phủ tạng được cắt và xay nhỏ chia làm 3 phần nhằm mục đích:

- Phân tích tìm chất độc bay hơi;

- Phân tích tìm chất độc hữu cơ;

- Phân tích tìm chất độc vô cơ.

3.Quy trình xác đinh các chất độc trong phủ tạng độc vật thí nghiệm

3.1. Xác định các chất độc bay hơi

3.1.1. Chuẩn bị dụng cụ

Lắp bộ cất kéo theo hơi nước: Rửa sạch các ống dẫn hơi bằng hơi nước nóng, chuẩn bị bình sinh hơi nước đã được đun sôi từ trước.

Chuẩn bị các bình hứng: 02 bình nón có nắp mài, đánh số 1 & 2 dung tích 100ml có chứa sẵn 5 ml nước cất đã được kiềm hoá trước tới pH=9-10, bằng dung dịch NaOH hoặc KOH 30% và 01 bình hứng có sẵn 10ml nước Brom bão hoà. Tất cả hai bình hứng khi tiến hành hứng dịch cất kéo bằng hơi nước phải đặt trong 01 bát sứ có chứa đá để làm lạnh.

3.1.2. Chuẩn bị mẫu thử

Lấy khoảng 5 gam phủ tạng động vật thí nghiệm xay nhỏ bằng máy xay thịt, cho vào bình cất có dung tích 250ml, thêm 25ml nước để tạo thành hỗn hợp đặc sệt, lắc đều. Thêm 5ml Acid sulfuric 10% lắc nhẹ và lắp ngay vào bộ cất kéo hơi nước đã chuẩn bị trước.

Làm nóng đều bình đựng mẫu lên từ từ rồi tăng mạnh nhiệt độ bình sinh hơi để cho hơi nước sục mạnh vào bình đựng mẫu phủ tạng.

3.1.3. Xác định chất độc bay hơi

- Hứng trực tiếp vào bình hứng số1 từ 15-20 ml dịch cất đầu tiên để sơ bộ tìmcyanua, các hợp chất Clo hữu cơ.

-Trong quá trình cất, nếu thấy dịch hứng trong kiềm ở bình hứng có màu vàng chanh thì đó có thể là các thuốc bảo vệ thực có gốc paranitrophenol (wofatox, parathion).

- Các phản ứng tìm Clo hữu cơ sau khi thuỷ phân bằng HNO3 và tìm Cl-bằng AgNO3 để xác định các thuốc BVTVnhư DDT, 666, cypermethrin....

- Muốn tìm các loại chất độc có kẽm thì hứng dịch cất bay hơi vào bình nón thứ 2 đã chuẩn bị có sẵn 10ml dung dịch nước brom bão hoà. Hứng cho tới khi dịch cất nhỏ xuống, không làm mất màu vàng của nước brom bão hoà tức là lúc kết thúc quá trình cất. Lấy dịch cất được cô trên bát sứ để giảm thể tích và đuổi hết brom thừa (hết màu vàng). Sau đó, tiến hành tìm phosphat bằng thuốc thử nitromolipdic và định lượng chúng bằng phương pháp đã quy định.

3.2. Xác định các chất độc hữu cơ

Phủ tạng động vật được xay nhỏ, ngâm  bằng cồn ethanol. Thêm dung dịch axit tactric 30% trong ethanol tới khi pH=4-5 trong 1 bình nón, nắp màimiệng rộng, có dung tích khoảng 250ml.Đậy kín,để khoảng 24 giờ.Lọc bằng giấy lọc gấp nếp,lấy dịch lọc,cô trên cách thuỷ tới dạng sền sệt như sirô, để nguội. Loại albumin bằng cáchdùng đũa thuỷ tinh khuấy nhẹ, vừa khuấy vừa cho thêm cồn ethanol 96° tới khi không còn thấy tủa anbumin màu trắng đục xuất hiện. Lọc qua giấy lọc gấp nếp,lấy dịch lọc và tiếp tục loại anbumin như trên1 hoặc 2 lần nữa đến khi nhỏ 1 giọt cồn ethanol vào dịch cô đặc không thấy tủa màu trắng xuất hiện là việc loại anbumin đã hoàn thành.Dịch cô đặc trên được hòa vào 40-50 ml nước cất, lọc qua giấy lọc,dung dịch nước lọc ở pH =4-5 trên được chiết xuất bằng 20mlether dầu hoả 1-2 lần để loại mỡ và các tạp chất tương tự ra khỏi dịch lọc. Bỏ phần ether dầu hoả phía trên,lớp nước được chiết xuất nhiều lần liên tiếp ở môi trường axit (pH =4-5) và môi trường kiềm (pH =9-10) bằng ether hoặc cloroform.

 Loại dung môi bằng cách cô chân không,sẽthu được cặn khô chiết ở 2 môi trường axit và kiềm. Hòa tancặn này trong dung môi thích hợp để xác định các chất độc hữu cơ bằng các phương pháp như GC, HPLC, quang phổ.

3.3. Phương pháp phân tích các chất độc vô cơ

3.1. Phương pháp vô cơ hóa ướt trong bình keldan

Phủ tạng động vật được xay nhỏ, cho vào bình kendal có dung tích thích hợp, thêm 25ml nước cất, khuấy đều,thêm từ từ 25 ml axit sunfuric đặc(d=1,98),vừa cho vừa khuấy nhẹ. Đặt mẫu thử lên đèn gaz(đun cách lưới amian), đốt từ từ cho mẫu thử tan nhuyễn hết, vừa đốt vừa cho từng giọt acid nitric 50% đến khi mẫu thử có màu vàng (chú ý không để mẫu phủ tạng bị cháy đen). Ngừng đốt, để nguội, lọc(gạn) bỏ lớp mỡ bên trên, lấy dịch trong (5ml) xác định sơ bộ thuỷ ngân. Nếu có thuỷ ngân, dùng 1/2 lương mẫu thử để định lượng thuỷ ngân. Lượng mẫu thử còn lại tiếp tục tăng nhiệt độ đốt mạnh. Nếu thấy mẫu thử có màu vàng nâu hoặc đen thì phải cho từ từ ít một dung dịch axit nitric 50% hoặc nước oxy già 30% thể tích đến khi mẫu thử có màu trắng và có khói trắng bốc lên là quá trình vô cơ hoá hoàn thành. Dịch vô cơ hoá này dùng để phân tích các độc chất có chứakẽm, asenic, chì, vv…

Trong quá trình vô cơ hóa, có thể nhận xét sơ bộ:

-Nếu có tủa màu trắng lắng xuống bình keldal thì có thể là tủa PbSO4

-Nếu dịch vô cơ có màu xanh thì có thể có muối crom III hoặc CuSO4, vv...

3.2. Phương pháp vô cơ hoá khô bằng natri kim loại

Phương pháp này được áp dụng để vô cơ hoá trong trường hợp lượng phủ tạng động vật thí nghiệm ít hoặc rất ít. Lấy một lượng phủ tạng cho vào một ống nghiệm.Thêm 0,5g Canci cacbonat và 0,1g natri kimloại và đốt ống nghiệm trên ngọn lửa đèn gaz, cho tới khi nóng đỏ đáy ống nghiệm. Nhúng ngay đáy ống nghiệm vào 10ml nước cất đã chuẩn bị sẵn trong 1 cốc thuỷ tinh có mỏ. Rửa mảnh vỡ của ống nghiệm bằng nước cất và gộp dịch rửa với dịch trong cốc thuỷ tinh có mỏ, lọc qua giấy lọc gấp nếp đã thấm ướt bằng nước cất. Điều chỉnh thể tích của dịch lọc tới thể tíchcần thiết (bằng cách cô) và điều chỉnh đếnpH thích hợp để tìm các nguyên tố:S, P, Cl,vv...bằng các phương pháp thích hợp.

Suckhoecuocsong.vn/Theo Tạp chí thử nghiệm ngày nay