Phương pháp phát hiện nhanh kháng kháng sinh Macrolide

5/10/2019 10:29:00 AM
Kháng kháng sinh đang nổi lên là mối đe dọa đáng kể đối với sức khỏe con người. Tuy nhiên, các phương pháp chẩn đoán nhanh kháng kháng sinh thường yêu cầu thử nghiệm nuôi cấy nhiều ngày.

Thuốc kháng sinh được coi là một giải pháp trong điều trị các bệnh do nhiễm vi khuẩn. Nhờ có thuốc kháng sinh đã giúp kiểm soát được nhiều dịch bệnh nguy hiểm. Kháng kháng sinh xảy ra tự nhiên, nhưng việc sử dụng không đúng ở người và động vật đang đẩy nhanh quá trình kháng kháng sinh. Kháng kháng sinh đang gia tăng mức độ nguy hiểm ở tất cả các nơi trên thế giới, ảnh hưởng đến khả năng điều trị các bệnh nhiễm trùng, làm sức khỏe suy yếu và giảm tiến bộ của thuốc điều trị, đòi hỏi phải có sự nỗ lực cùng nhau nhằm giúp nhân loại tránh khỏi nguy cơ quay trở lại thời kỳ chưa có kháng sinh. Bài viết giới thiệu với quý bạn đọc các thảo luận, chi tiết về một số phương pháp thử nghiệm mới, phương pháp thử nghiệm RPA phát hiện kháng kháng sinh; kết quả và kết luận về phương pháp thử nghiệm này.

          Kháng kháng sinh đang nổi lên là mối đe dọa đáng kể đối với sức khỏe con người. Tuy nhiên, các phương pháp chẩn đoán nhanh kháng kháng sinh thường yêu cầu thử nghiệm nuôi cấy nhiều ngày. Gen mef (A) không hấp thu kháng sinh nhóm macrolide (sau đây gọi tắt là mef (A)), cung cấp tính kháng với erythromycin và azithromycin và được biết là xuất hiện trong một loạt các chủng vi khuẩn.

Phương pháp

          Chúng tôi sử dụng thử nghiệm enzym tái tổ hợp recombinase polymerase Assay (RPA) để phát hiện gen kháng kháng sinh mef (A) từ các lysate thô mà không cần tinh chế axit nucleic. Để xác nhận những kết quả này, chúng tôi đã thực hiện các thử nghiệm pha loãng dung môi để đánh giá khả năng kháng vi khuẩn đối với erythromycin và ampicillin (một biện pháp kiểm soát âm tính).

          Chúng tôi xác nhận việc phát hiện mef (A) trong các lysates thô của streptococcus pyogenes, S. pneumoniae, S. salivarius và enterococcus faecium lysates trong vòng 7-10phút  của thời gian thử nghiệm. Chúng tôi thấy rằng việc phát hiện mef (A) dự đoán chính xác khả năng kháng vi khuẩn thực sự được đánh giá bằng các phương pháp nuôi cấy truyền thống, và thử nghiệm này rất mạnh đối với các chất gây ô nhiễm axit nucleic không đặc hiệu. Thử nghiệm không bị ảnh hưởng bởi các đa hình đơn nucleotide trong chuỗi gen mef (A) phân kỳ, củng cố tiện ích của nó như một công cụ chẩn đoán mạnh mẽ.

          Phát hiện này mở ra cơ hội thực hiện chẩn đoán gen nhanh chóng trong môi trường lâm sàng, đồng thời cung cấp cho các nhà nghiên cứu một công cụ nhanh chóng, hiệu quả để theo dõi tình trạng.

          Phòng chống kháng kháng sinh (AMR) là ưu tiên quốc gia và quốc tế. Viện Y tế Quốc gia Hoa Kỳ, Trung tâm Kiểm soát Bệnh tật, Tổ chức Y tế Thế giới và Liên Hợp Quốc đã ưu tiên vấn đề này. Vào ngày 18 tháng 9 năm 2014, cựu Tổng thống Barack Obama đã ban hành Sắc lệnh hành pháp tập trung vào AMR 13676, sau đó là Kế hoạch hành động quốc gia về chống vi khuẩn kháng kháng sinh.

          Tuy nhiên, giám sát kháng kháng sinh là một thách thức đáng kể, gây khó khăn trong việc tìm kiếm phương pháp đánh giá nguy cơ thực tế và làm giảm khả năng hình thành các dự đoán trong tương lai. Các phương pháp đánh giá kháng kháng sinh hiện nay là cực kỳ chậm, cần nhiều ngày đến vài tuần thời gian nuôi cấy, và cũng tốn kém về vật liệu phòng thử nghiệm và công sức của kỹ thuật viên. Đồng thời, chúng được triển khai không đồng đều, sai lệch ước tính của chúng tôi về AMR trên toàn thế giới và ức chế khả năng đánh giá chính xác nguy cơ này đối với sức khỏe con người. Đáp lại nhu cầu cần phương pháp chẩn đoán mới, chúng tôi báo cáo một phương pháp chẩn đoán gen đơn giản, nhanh chóng để phát hiện kháng kháng sinh trong vòng 10 phút sau khi thử nghiệm. Chúng tôi cũng xác nhận một phương pháp chuẩn bị lysate thô đơn giản mà không cần tinh chế axit nucleic. Những đổi mới này giải quyết một nhu cầu quan trọng trong giám sát kháng kháng sinh.

          Phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt (RPA), một phương pháp thay thế đẳng nhiệt cho phản ứng chuỗi polymerase (PCR), sử dụng phức hợp đoạn mồi tái tổ hợp để xác định và làm biến dạng đoạn gen quan tâm, cùng với các protein liên kết DNA chuỗi đơn để ổn định DNA mở. Phát hiện tương tự như các đầu dò thủy phân Taq-Man ngoại trừ đầu dò chứa chất tương tự vị trí abasic bên trong, tetrahydrofuran, được phân tách bởi endonuclease IV (nfo) trong quá trình khuếch đại. Các polymerase được sử dụng là Bsu thay thế sợi, có khả năng chống ức chế hóa học cao hơn Taq, giúp RPA mạnh hơn so với PCR. Do quá trình biến tính DNA được thực hiện bởi protein chứ không phải nhiệt, RPA xảy ra đẳng nhiệt, thường là 37°C - 42°C và nhiều tài liệu báo cáo đã cải thiện tốc độ của RPA so với PCR, thường được phát hiện trong vòng 5 phút-7 phút. Ngoài ra, RPA thể hiện độ nhạy cực cao, thường phát hiện hàng chục bản sao của mục tiêu axit nucleic.

          Mặc dù RPA chưa được thực hiện rộng rãi trong môi trường lâm sàng, nhưng nó đã được chứng minh có khả năng phát hiện mầm bệnh của vi khuẩn, virus và động vật nguyên sinh. Các mầm bệnh sinh vật nhân thực được phát hiện với RPA bao gồm schistosoma japonicum trong máu và mầm bệnh tiêu chảy do ký sinh trùng giardia, cryptosporidium và entamoeba. Các mầm bệnh virus được phát hiện bởi RPA bao gồm HIV, virus chikungunya (CHIKV), virus Sốt thung lũng Rift , coronavirus hội chứng hô hấp Trung Đông, virus bệnh lở mồm long móng (FMDV) ), bovine coronavirus và virus sốt xuất huyết crimean-Congo (CCHFV). Các mầm bệnh vi khuẩn được phát hiện bởi RPA bao gồm mycoplasma tuberculosis, neisseria gonorrhoeae, salmonella enterica và staphylococcus aureus (MRSA), chlamydia trachomatis, francisella, orientia tsutsugamushi (chà là typhus) và rickettsia typhi (murine typhus).

Trong các ứng dụng chẩn đoán, RPA đã được chứng minh là có độ đặc hiệu cao và do đó có khả năng chống lại dương tính giả (lỗi loại I). Trong một số trường hợp, độ đặc hiệu 100% đã được hiển thị. Các rủi ro sức khỏe do sai lầm trong phát hiện và điều trị, độ đặc hiệu cao là một đặc điểm quan trọng của thử nghiệm chẩn đoán. Lỗi loại II (âm tính giả) luôn có thể xảy ra nếu mục tiêu gây bệnh xuất hiện ở mức thấp trong mẫu, nhưng độ nhạy tinh tế của RPA (xem ở trên) giảm thiểu rủi ro này.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã phát triển và thử nghiệm một thử nghiệm RPA mới để phát hiện gen A không hấp thụ kháng sinh macrolide, hoặc mef (A), một loại bơm efflux làm cho vi khuẩn chủ kháng kháng sinh nhóm macrolide 14 và 15 (bao gồm cả erythromycin A và azithromycin). Gen này có thể được tìm thấy trong streptococcus pyogenes, thành viên lớn nhất của nhóm lancefield a streptococci, nơi nó được mã hóa trên một đoạn chuyển vị tích hợp vào một thực khuẩn thể. Mặc dù ban đầu được xác định ở S. pyogenes và S. pneumoniae nhưng nó đã được xác định trong một phạm vi cực kỳ rộng của vi khuẩn gram dương và âm tính trên toàn thế giới phù hợp với việc chuyển ngang các gen kháng kháng sinh.

Sử dụng DNA tinh khiết, một nhóm nuôi cấy vi khuẩn và thử nghiệm kháng kháng sinh pha loãng dung môi, chúng tôi chứng minh độ nhạy và độ đặc hiệu cực cao của thử nghiệm RPA và xác nhận rằng, kết quả dương tính dự đoán chính xác khả năng kháng vi khuẩn. Thử nghiệm RPA của chúng tôi đã phát hiện ra sự xuất hiện bất ngờ của gen mef (A) trong chủng vi khuẩn streptococcus salivarius hồi sinh và thử nghiệm trong phòng thử nghiệm sau đó đã xác nhận rằng chủng này có khả năng kháng khuẩn thực sự. Mặc dù S. salivarius được biết đến là thường xuyên chứa các gen kháng kháng khuẩn, nhưng đây là trường hợp đầu tiên, theo hiểu biết của chúng tôi, về kháng kháng sinh được phát hiện đầu tiên bởi RPA và được xác nhận bằng các phương pháp truyền thống hơn.

Ảnh minh họa. Nguồn Internet

Chủng vi khuẩn

Streptococcus pyogenes chủng MGAS 10394 (ATCC BAA-946) và MGAS 6180 (ATCC BAA-1064), được lấy trực tiếp từ ATCC (Manassas, VA). Streptococcus agalactiae (NR-44140), S. pneumoniae GA17457 (NR-19118), S. pneumoniae GA16242 (NR-19111), S. pneumoniae NP112 (NR-19213) và E. faecium Strain 513 (HM-9513) được đưa ra từ nguồn beiresource.org (Manassas, VA). Streptococcus salivarius do phòng thử nghiệm Kaplan của Đại học Mỹ (Washington, DC) phân lập với sự chấp thuận của IRB và sự đồng ý của bệnh nhân cho nghiên cứu.

Sự hiện diện hay vắng mặt của gen mef (A) và ermB được đánh giá bằng vụ nổ cục bộ so với bộ gen được công bố và tải xuống từ các phần sau của genBank: S. pyogenes MGAS10394, gia nhập CP000003.1; S. pyogenes MGAS6180, gia nhập CP000056.1; S. pneumoniae chủng GA17457, gia nhập AILS00000000.1; S. pneumoniae GA16242, gia nhập AGPE00000000.1; S. pneumoniae chủng NP112 gia nhập AGQF00000000.1; S. agalactiae SGBS025, gia nhập AUwe00000000.1; và enterococcus faecium strain 513 gia nhập AMBG00000000.1

Thử nghiệm kháng sinh bằng cách pha loãng dung môi

S. pyogenes, S. agalactiae và S. salivarius đã được kiểm tra độ mẫn cảm kháng kháng sinh bằng cách pha loãng dung môi. Ampicillin (Cat # 97061 mạnh442) được lấy từ VWR (Amresco) và erythromycin (Cat # TCE0751-5G) được lấy từ VWR (TCI). Vi khuẩn được duy trì trên các đĩa thạch máu ở 37°C và các khuẩn lạc đơn lẻ được chọn để cấy vào môi trường nuôi cấy qua đêm trong dịch truyền vô trùng brain-heart infusion (BHI, VWR Cat # 90003 Nott038). Đối với mỗi môi trường nuôi cấy, 14 ml môi trường BHI được cấy vào ống falcon 15 ml kín để ủ qua đêm ở 37°C (không lắc). Đảo ngược nhẹ nhàng được sử dụng để trộn các vi khuẩn được cấy trước khi thiết lập thử nghiệm.

Đối với thử nghiệm, 5 μl môi trường nuôi cấy qua đêm được trộn với 5 ml môi trường BMI (pha loãng 1000 lần) trong một khay vô trùng và trộn nhẹ. Nuôi cấy loãng này được thêm vào 180 μl mỗi lỗ của một đĩa 96 lỗ được nạp sẵn 20 μl dung dịch kháng sinh khác nhau, đối với erythromycin, từ 0,5 đến 32 g/ml (10 x) để tạo ra nồng độ cuối cùng mong muốn là 0,05. gg/ml. Đối với ampicillin, lượng dự trữ là 1,25 μg/ml-80 g/ml dẫn đến nồng độ cuối cùng là 0,125 g/ml-8 g/ml. Sau đó, đĩa 96 lỗ được chuyển sang đầu đọc vi mạch filterMax F5 trong 20 giờ ở nhiệt độ 37°C, với số lần đọc được thực hiện sau mỗi 30 phút. Cần rung lắc theo quỹ đạo trong 10 giây trước mỗi lần đọc.

Thử nghiệm tính đặc hiệu và nuôi cấy tế bào gốc chiết xuất từ mỡ

Để kiểm tra tính đặc hiệu, DNA của người được lấy từ dòng tế bào gốc có nguồn gốc từ mỡ ASC080414A (thu được từ zen-bio, raleigh, NC) được nuôi cấy trong tủ ấm CO2 5% ở 37°C. Các phương tiện tăng trưởng bao gồm modified eagle medium (DMEM, thermofisher # 11965118) của dulbecco được bổ sung 10% huyết thanh bào thai bò (thermoFisher # 10082147), 1X penicillin/ streptomycin (thermoFisher # 15140122) và 1X 3 ngày. Tổng DNA được tinh chế bằng cách sử dụng bộ mô nucleospin (Macherey-Nagel, Düren, Đức) và định lượng trên máy đo lưu huỳnh qubit (thermoFisher), cũng được sử dụng để đo DNA vi khuẩn được giải phóng trong dung dịch lọc thô.

Thử nghiệm RPA

Các đoạn mồi và đầu dò cho thử nghiệm RPA mef (A) được thiết kế theo hướng dẫn do TwistDx (Cambridge, Vương quốc Anh) cung cấp. Tất cả các mồi và thăm dò được tổng hợp bởi công nghệ DNA tích hợp (coralville, Iowa). Đối với tất cả các thử nghiệm RPA, bộ công cụ TwistDx nfo (TANFO02KIT, TwistDx, Cambridge, UK) đã được sử dụng theo thỏa thuận với hướng dẫn của nhà sản xuất. Đối với mỗi phản ứng, hỗn hợp hydrat hóa đã được chuẩn bị bao gồm 4.2 μl cặp mồi RPA (2.1 μl của mỗi mồi 10 μM), 0,6 probel đầu dò (10 μM), 29,5 μl dung dịch đệm bù và 13,2 μl mẫu chứa DNA được kiểm tra (tổng cộng 47,5 μl). Sau đó, hỗn hợp hydrat hóa được thêm vào một ống phản ứng có chứa các viên enzyme đông khô twistAmp. Hỗn hợp thu được được trộn cẩn thận qua pipet 3-4 lần để tránh đưa bong bóng vào và chuyển vào đĩa 96 lỗ qPCR (agilent cat # 410088). Nồng độ cuối cùng của mồi là 420 nM và đầu dò là 120 nM. Để kích hoạt phản ứng, 2,5 μl dung dịch gốc magiê acetate (280 mM) đã được thêm vào nắp của đĩa 96 lỗ, trộn nhanh qua đảo ngược, ngay lập tức được đặt vào máy qPCR (Agilent Stratagene Mx3005P). Duy trì phản ứng ở nhiệt độ không đổi 37°C trong 30 phút, với tín hiệu FAM được ghi lại sau mỗi 30 giây (tổng số 60 lần đọc).

Kết quả

Chúng tôi đã thiết kế một đầu dò thủy phân theo phong cách Taq-Man kết hợp fluorophore (FAM) và chất khửtrùng (Iowa black), đóng vai trò là một công cụ chặn 3 đầu. Sự khuếch đại thành công dẫn đến sự phân tách đầu dò bằng endonuclease IV (nfo) tại điểm abasic, tách FAM khỏi chất khử và thu được tín hiệu có thể phát hiện được. Công việc trước đó đã sử dụng một chất khử và FAM trong nội bộ, gần với điểm abasic; thiết kế của chúng tôi đơn giản hóa điều này bằng cách sử dụng chất khử chất làm bộ chặn 3′.

Thiết kế và kiểm tra độ nhạy của thửnghiệm RPA đối với gen mef (A). Sơ đồ thiết kế đầu dò và mồi. Đầu dò thủy phân kiểu Taq-Man bị cắt bởi endonuclease nfo trong quá trình khuếch đại, giải phóng chất khử và kích hoạt tín hiệu FAM. Thử nghiệm độ nhạy RPA bằng cách sử dụng các pha loãng DNA nối tiếp từ chủng streptococcus pyogenes do mef (A) giả định MGAS10394. So sánh với qPCR bằng cách sử dụng các đoạn mồi từ RPA (b), nhưng sử dụng sybr green làm chỉ số đọc thay vì FAM (đầu dò không được sử dụng).

Để đánh giá độ nhạy của thử nghiệm, chúng tôi đã tiến hành pha loãng DNA nối tiếp có nguồn gốc từ mef (A) streptococcus pyogenes serotype M6 chủng MGAS10394 và thấy rằng, phát hiện khoảng 2000 bản sao bộ gen. Hai nghìn bản sao bộ gen tương ứng với 4,3 picogram (pg) DNA, với nồng độ 252 femtomole (fM). Mặc dù tín hiệu FAM vượt qua ngưỡng của các bản sao bộ gen 200, 20 và 2, các tín hiệu này có thể không đặc hiệu như thể hiện qua các điều khiển tiêu cực cho thấy tín hiệu tăng muộn (khoảng 20 phút trở lên) tương tự. Chúng tôi kết luận rằng, giới hạn độ nhạy tự tin của thử nghiệm của chúng tôi là khoảng 2000 bản sao bộ gen và phát hiện đó phải được ghi lại trước 16 phút để được coi là có thật.

Tín hiệu 18-20 phút không đặc hiệu luôn dễ dàng phân biệt với phát hiện thực trong các thử nghiệm của chúng tôi, luôn phát ra nhanh chóng, khoảng 7-10 phút. Chúng tôi đề xuất tín hiệu tăng muộn tương tự như xu hướng qPCR, có thể khuếch đại khắp nơi ngay cả tại các điều khiển không có khuôn mẫu trong 40 chu kỳ. Chúng tôi đã thực hiện qPCR dựa trên SYBR trên cùng một chuỗi pha loãng DNA, bằng cách sử dụng cùng một đoạn mồi và quan sát thấy độ nhạy cao hơn nữa, tương đối tự tin xuống tới 20 bản sao bộ gen, nhưng nó chạy chậm hơn đáng kể trong 2 giờ. Ngưỡng sao chép 2000 bộ gen có thể giúp phân biệt tải gen mef (A) có ý nghĩa chẩn đoán, thay vì chỉ là các khuẩn lạc.

Tiếp theo, chúng tôi đã thực hiện thử nghiệm tính đặc hiệu với các lysates vi khuẩn thô từ tám chủng vi khuẩn. Mef (A) có mặt trong bộ gen của chủng strep nhóm S. pyogenes MGAS10394 và S. pneumoniae chủng GA17457 và GA16242. Các chủng âm tính mef (A) được biết đến bao gồm S. pyogenes MGAS6180 chịu trách nhiệm cho viêm nhiễm hoại tử và nhiễm trùng huyết puerperal, enterococcus faecium Strain 513, S. pneumoniae chủng NP112 và S. agalactiae SGBS025. Streptococcus agalactiae kháng với macrolide theo cơ chế khác với mef (A): nó chứa một methylase ribosomal mục tiêu, ermB. Sự methyl hóa vị trí mục tiêu trong rRNA 23S bởi ermB ức chế sự tương tác của kháng sinh với ribosome. Do đó, chúng tôi đã dự đoán và đã xác nhận rằng, loại này sẽ cho thấy sự vắng mặt của mef (A) do RPA nhưng dù sao cũng cho thấy khả năng kháng erythromycin mạnh mẽ. Cuối cùng, chúng tôi đã thử nghiệm một bệnh nhân phân lập S. salivarius với tình trạng mef (A) không xác định. Các đặc điểm của các chủng S. salivarius, S. agalactiae và S. pyogenes đã được xác nhận bằng cách giải trình tự các locus 16 s rDNA.

Thử nghiệm kháng sinh để xác nhận kháng erythromycin ở S. salivarius, MGAS10394 và S. agalactiae. Ampicillin đóng vai trò kiểm soát âm tính (tất cả các chủng nhạy cảm). a + b, Chỉ phương tiện. c + d, MGAS10394 (mef (A) dương). e + f, MGAS6180 (mef (A) âm). g + h, S. agalactiae (ermB dương tính và mef (A) âm tính). i + j, S. salivarius (mef (A) dương).

Chúng tôi đã phát triển một phương pháp ly giải thô đơn giản. Các khuẩn lạc vi khuẩn riêng lẻ được cấy vào môi trường BHI để ủ qua đêm ở 37°C, sau đó ly giải bằng cách đun sôi ở 95°C trong 3 phút và pha loãng 100 lần vào H2O vô trùng. RPA được thực hiện trực tiếp trên lysate thô này. Chúng tôi đã thử nghiệm tổng cộng tám chủng vi khuẩn: S. pyogenes (2 chủng), S. agalactiae, S. salivarius, S. pneumoniae (3 chủng) và E. faecium. RPA đã xác nhận sự hiện diện của mef (A) trong tất cả các chủng dương tính đã biết và không có bất kỳ tiêu cực phản ứng nào xảy ra. RPA chỉ ra sự hiện diện của mef (A) trong S. salivarius, một kết quả bất ngờ. Mặc dù chúng tôi không mong đợi loài sinh vật này có chứa mef (A), tuy nhiên chúng tôi vẫn thực hiện PCR xác nhận sự hiện diện của gen ở MGAS10394 và S. salivarius. Bằng cách giải mã trình tự sản phẩm này, chúng tôi đã quan sát thấy gen S. salivarius có ba đa hình đơn nucleotide, cho thấy rằng, nó đã thu được một bản sao gen khác biệt hơn và xác nhận rằng các phát hiện tạo thành gen mef (A) độc lập, không lây nhiễm chéo.

Để kiểm tra xem gen mef (A) có hoạt động hay không, chúng tôi đã thực hiện pha loãng dung môi của cả hai chủng S. pyogenes, S. salivarius và S. agalactiae với erythromycin và ampicillin (kiểm soát âm tính). Điều này khẳng định rằng, S. pyogenes MGAS10394, S. agalactiae và S. salivarius đều kháng với erythromycin (MIC lớn hơn hoặc bằng 3,2 g/ml, bảng 2) và MGAS6180 dễ bị ảnh hưởng. Theo báo cáo của những người khác, ermB cho kháng erythromycin mạnh hơn mef (A), với S. agalactiae cho MIC> 3,2 g/ml. Tất cả các chủng đã được thử nghiệm đều nhạy cảm với ampicillin như mong đợi.

Để đánh giá độ đặc hiệu của thử nghiệm, chúng tôi đã xây dựng các hỗn hợp axit nucleic như sau: A, B và C chứa 20 ng DNA từ các lysates không phải là mef (A) (S). agalactiae cộng với MGAS6180) hoặc tự tạo (A) hoặc 0,34 ng (B) của MGAS10394 (mef (A) -poseitive). Hỗn hợp A và B tương ứng là 7,8 và 1,7% mef (A) dương. Hỗn hợp D và E đã kiểm tra tác động của DNA người, có thể được dự kiến sẽ làm nhiễm bẩn các mẫu lâm sàng. Do đó, chúng tôi đã thử nghiệm 450 ng DNA người (D) hoặc với 4,5 ng (1%) MGAS10394 lysate (E) giả định mef (A). Không có DNA không đặc hiệu nào có ảnh hưởng rõ ràng đến các phản ứng, chỉ có E, A và B cho tín hiệu cụ thể và tỷ lệ với tổng gen mef (A) có trong các mẫu (4,5 ng,1,7 ng và 0,34 ng, tương ứng). Các mẫu C và D của mef (A) không có tín hiệu cụ thể, cho thời gian không đạt ngưỡng cụ thể lần lượt là 19,1 và 19,6 phút. Những kết quả này không chỉ cho thấythử nghiệm RPA có tính đặc hiệu và định lượng 100% khi có DNA không đặc hiệu, mà còn có chức năng với một loạt DNA tổng số trong hỗn hợp và mạnh mẽ đối với các điều kiện của lysate thô bao gồm protein bị biến tính, lipit và các mảnh vụn của thành tế bào.

Kết luận

Chẩn đoán bộ gen cung cấp sự linh hoạt về nguyên tắc phát hiện vật liệu di truyền trong bất kỳ mầm bệnh nào, bỏ qua các thách thức liên quan đến các thử nghiệm dựa trên kháng thể tạo ra nhiều khó khăn hơn trong khi sản xuất cũng nhạy cảm hơn so với phương pháp dựa trên axit nucleic. Ví dụ, hai phân tích tổng hợp của thử nghiệm nhanh dựa trên kháng nguyên đối với viêm họng do vi khuẩn streptococcal nhóm A cho thấy độ nhạy 86%, vì vậy 14% dương tính thực sự bị bỏ qua bởi phương pháp này. Ở đây, chúng tôi chứng minh một quy trình phân tích hệ gen dựa trên RPA đơn giản mang lại sự linh hoạt và phát hiện nhanh trong một khung thời gian tương tự như các thử nghiệm nhanh (10-15 phút) phù hợp với ứng dụng thử nghiệm tại chỗ. Chúng tôi cho thấy rằng, có thể phát hiện xuống mức femtomolar (fM) / picogram (pg); việc tăng vọt trong DNA không đặc hiệu lên tới 100 lần so với DNA mef (A) + không ức chế thử nghiệm, vẫn cực kỳ định lượng và đặc hiệu cho mục tiêu thực sự.

Việc phát hiện các gen kháng kháng sinh đã được thực hiện thường xuyên hơn với khuếch đại đẳng nhiệt qua trung gian vòng (LAMP) thay vì RPA. Các ví dụ bao gồm phát hiện beta-lactamase quy định cho tính kháng carbapenem trong acinetobacter baumannii, gen integron-integrase lớp 1 intI1 từ các mẫu môi trường, msrA từ staphylococcus aureus và mcr-1. Trong mọi trường hợp, phát hiện xảy ra trong vòng 20-50 phút và độ nhạy thường nằm trong phạm vi picogram. Ngược lại, RPA cung cấp một hệ thống đơn giản hóa với ít mồi hơn thường cho kết quả trong vòng chưa đến 10 phút.Đây có thể là một lợi thế về thời gian, quan trọng trong một số cài đặt nhất định như các ứng dụng lâm sàng. Trái ngược với LAMP, phát hiện genomic của kháng kháng sinh bằng RPA vẫn còn ở giai đoạn sơ khai và đã có nhiều tiến bộ hơn trong việc xác định các đa hình nucleotide đơn có khả năng kháng thuốc. Trong một nghiên cứu, một alen kháng thuốc HIV đã được RPA phát hiện kết hợp với thử nghiệm thắt oligonucleotide. Nghiên cứu khác đã xác định các biến thể trình tự bệnh lao đa kháng thuốc bằng cách sử dụng phương pháp RPA lồng nhau.

Nghiên cứu gần đây đã chứng minh cảm biến transitor màng mỏng cho RPA giúp tăng tốc đáng kể thời gian đọc, sử dụng thay đổi pH trong quá trình khuếch đại DNA làm tín hiệu điện. Các mục tiêu phân tử trong nghiên cứu đó là beta lactamase có khả năng kháng cephalosporin và carbapenem, và phát hiện đã đạt được trong vòng 2-5 phút.Tuy nhiên, những dữ liệu này không bao gồm các thử nghiệm về tính đặc hiệu của thử nghiệm cũng như đo lường mức độ kháng kháng sinh ở vi khuẩn. Những kết quả này hỗ trợ rộng rãi cho phát hiện của chúng tôi:  RPA là một cách tiếp cận ưu việt để thử nghiệm kháng kháng sinh hệ gen. Các công nghệ đọc kết quả cải tiến hứa hẹn sẽ cải thiện hơn nữa hiệu suất tạm thời của các thử nghiệm này ngoài thời gian phát hiện 7-10 phút mà chúng tôi thực hiện, đồng thời cung cấp nhiều hệ thống di động hơn cho phân tích tại điểm hoặc sử dụng tại hiện trường.

Công việc của chúng tôi là kịp thời, tập trung vào kho chứa các gen kháng kháng khuẩn (‘resistomes tựa) trong miệng và ruột. Thử nghiệm RPA của chúng tôi cho mef (A) rất nhạy (giảm đến mức picogram) và độ nhạy này có thể mang lại tiềm năng chẩn đoán mới. Tuy nhiên, sự tồn tại của các gen kháng kháng khuẩn trong các chủng của khoang miệng ngay cả ở những người khỏe mạnh làm tăng mối lo ngại rằng thử nghiệm kháng kháng sinh rất nhạy cảm như chúng ta có thể phát hiện ra gen khi không có nhiễm trùng.Song, hiểu được động lực học và sự biến đổi giữa các cá thể ngay cả trong một điện trở khỏe mạnh là một phần quan trọng của y học cá nhân hóa, bao gồm microbiome và các chất trung gian liên quan đến kháng kháng sinh. Bởi vì microbiome là một thực thể năng động, trong đó, các gen kháng kháng sinh được chia sẻ giữa các thành viên.Điều quan trọng về mặt lâm sàng là theo dõi mức độ gen kháng kháng sinh ở vi khuẩn commensal của những người khỏe mạnh có thể gây ra bệnh nặng hơn. Ví dụ, nhiễm trùng gây ra bởi bệnh xơ nang ngày càng kháng kháng sinh do sự chuyển đổi ngang của các gen kháng từ vi khuẩn commensal.

Cho đến nay, không có thử nghiệm nhanh, dễ dàng, rẻ tiền để đo mef (A) ở bệnh nhân microbiome khỏe mạnh, nhưng chúng tôi cung cấp một công cụ như vậy, được xác nhận để chỉ ra dấu hiệu di truyền tương quan với kháng erythromycin thực tế. Hơn nữa, có cái nhìn sâu sắc về sự hiện diện của các gen kháng trong hệ vi sinh vật (khỏe mạnh) của bệnh nhân sẽ thông báo chính xác

cho bác sĩ lâm sàng nếu người đó bị bệnh, giảm cả bệnh tật và thất bại điều trị và điều trị lại. Nói cách khác, một bệnh nhân có hàm lượng mef (A) cao trong microbiome khỏe mạnh sẽ được khuyên tốt nhất để tránh điều trị macrolide nếu mắc bệnh.

Câu hỏi liệu thử nghiệm RPA của chúng tôi có phân biệt nhiễm trùng với khuẩn lạc có liên quan đến một cuộc tranh luận lớn hơn trong lĩnh vực chẩn đoán hay không: khi nào thử nghiệm phân tử quá nhạy cảm? Các phương pháp phát hiện phân tử như qPCR hoặc RPA nhạy hơn nhiều so với phương pháp nuôi cấy, thường xác định nhiều vi khuẩn hơn nuôi cấy, khiến một số người kết luận rằng tiện ích chẩn đoán của các phương pháp này bị hạn chế do dương tính giả. Tuy nhiên, có một số phương pháp để giảm thiểu rủi ro này.Ví dụ, chỉ thử nghiệm các quần thể có nguy cơ, như được áp dụng để thử nghiệm vi khuẩn C. difficile hoặc streptococcus nhóm A (S. pyogenes). Phương pháp này giảm thiểu khả năng phát hiện dương tính giả bằng cách không sử dụng thử nghiệm trong các trường hợp không thể đại diện cho nhiễm trùng thực sự. Do đó, một bác sĩ lâm sàng có thể triển khai thử nghiệm mef (A) mới của chúng tôi khi bệnh nhân biểu hiện các triệu chứng phù hợp với nhiễm khuẩn, để hướng dẫn lựa chọn tác nhân điều trị. Phương pháp thứ hai và mạnh mẽ hơn là tập trung vào các cấp độ của chuỗi di truyền được quan sát. Nếu mef (A) đang giúp mầm bệnh gây bệnh, nó sẽ được làm giàu với số lượng bản sao cao hơn so với khi một khuẩn lạc lẻ tẻ được pha loãng vào một cộng đồng vi khuẩn khỏe mạnh. Bằng cách cung cấp dữ liệu định lượng về mức độ tương đối của mef (A), thử nghiệm RPA của chúng tôi phù hợp lý tưởng với phương pháp này, khiến việc xác định nhiễm trùng là vấn đề so sánh mức độ gen được phát hiện với giới hạn cho phép(sau khi bình thường hóa với tổng tải lượng vi khuẩn). Quan trọng, công việc trong tương lai phải tập trung vào việc thiết lập giới hạn cho phép theo kinh nghiệm bằng cách thử nghiệm nhiều mẫu lâm sàng, từ cả những người khỏe mạnh và bệnh nhân. Bằng cách xác nhận cung cấp một thử nghiệm phân tử nhanh chóng, dễ sử dụng, nghiên cứu hiện tại thể hiện bước đầu tiên quan trọng trong quy trình này.

Mef (A) đã được tìm thấy trong rất nhiều vật chủ vi khuẩn, từ neisseria gonorrhoeae đến enterococcus faecalis và streptococcus pneumoniae và pyogenes, và gần đây đã được tìm thấy trong các chủng salivarius khi chúng tôi xác nhận độc lập bằng RPA. Chúng tôi dự đoán thử nghiệm mef (A) được xác nhận trong công trình này sẽ trở thành một công cụ quan trọng trong hộp công cụ chẩn đoán, cung cấp cho các bác sĩ và các nhà khoa học một biện pháp kháng macrolide nhanh chóng, chính xác, cho dù được tích tụ ở đường hô hấp trên (S. pyogenes hoặc S. salivarius) hoặc đường hô hấp dưới (streptococcus pneumoniae hoặc staphylococcus aureus hoặc các loại khác), hoặc ở các khu vực khác của hệ vi sinh vật ở người.

Viết tắt

LAMP:  Loop-mediated isothermal AMPlification-khuếch đại đẳng nhiệt qua trung gian

Mef(A): Macrolide Efflux protein A- Gen mef (A) không hấp thu kháng sinh nhóm macrolide

MIC: Minimum Inhibitory concentration-nồng độ ức chế tối thiểu

qPCR: Quantitative polymerase chain reaction- Phản ứng chuỗi polymerase định lượng

RPA: Recombinase polymerase assay- Thử nghiệm tái tổ hợp polymerase

RPA: Recombinase polymerase amplification. RPA được giới thiệu lần đầu tiên vào năm 2006. Đây là là phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt ở nhiệt độ thấp từ 37-42°C và trong thời gian khoảng ngắn 5-20 phút nên có tính ứng dụng cao cho chẩn đoán bệnh ở hiện trường. RPA có thể sử dụng cho chẩn đoán bệnh và phát hiện đa hình nucleotide đơn ở ung thư của người và sinh vật biến đổi gen. Ngoài ra, RPA cũng có thể được ứng dụng trong kiểm tra vi sinh trong mẫu nước, thực phẩm và trong lĩnh vực trồng trọt, chăn nuôi.

Tài liệu tham khảo

1.National Institutes of Health: NIAID's Antibacterial Resistance Program: Current Status and Future Directions. https://www.niaid.nih.gov/sites/default/files/arstrategicplan2014.pdf. Accessed 1 Feb 2019.

2.CDC: Antibiotic / Antimicrobial Resistance. https://www.cdc.gov/drugresistance/index.html. Accessed 2 Feb 2019.

3.World Health Organization Global Action Plan on Antimicrobial Resistance. http://www.wpro.who.int/entity/drug_resistance/resources/global_action_plan_eng.pdf.

4.Editors PM. Antimicrobial resistance: is the world UNprepared? PLoS Med. 2016;13(9):e1002130.View ArticleGoogle Scholar

5. Obama B: Executive Order -- Combating Antibiotic-Resistant Bacteria. 2014. https://obamawhitehouse.archives.gov/the-press-office/2014/09/18/executive-order-combating-antibiotic-resistant-bacteria. Accessed 2 Feb 2019.

Suckhoecuocsong.vn/Theo Tạp chí Thử nghiệm Ngày nay

Các tin khác